专家点评｜孕期高糖糖尿病对后代影响的作用机理
小村庄的风流韵事，提示孕期的健康管理至关重要。然而，育龄妇女孕前期不良内环境是否能影响卵母细胞发育而损害子代健康尚不明确。糖尿病的发生率日趋增高且日益低龄化。全世界范围内有2/5的糖尿病妇女尚在育龄期，且仍有许多病人未得到及时的诊断和治疗这些育龄期妇女孕前期经历的高血糖等不良内环境能否通过卵母细胞进而损害其子代健康？其机制是什么？
2022年5月18日，Nature在线发表了主要由黄荷凤院士与徐国良院士领衔、由浙江大学、复旦大学、中科院细胞科学卓越创新中心、上海交通大学与和英国阿尔斯特大学等多家单位合作完成的研究工作的最新研究Maternal inheritance of glucose intolerance via oocyte TET3 insufficiency。该研究了高糖环境可卵母细胞中母源效应因子DNA双加氧酶TET3表达水平降低，造成受精后早期胚胎基因组DNA去甲基化障碍，引起胰岛素分泌通相关基因的启动子DNA异常高甲基化，这种高甲基化状态维持至成年期胰岛，进而这些基因的表达而诱发子代呈现糖耐量异常的表型。该工作提示卵母细胞TET3的正常功能可决定子代长期健康。
研究人员首先建立了链脲佐菌素（Streptozocin, STZ）的高血糖小鼠模型，模拟人类孕前高血糖环境，此后利用其卵母细胞在培养皿中进行体外受精，并将体外培养的二细胞胚胎移植到健康母鼠体内孕育子代。这种体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET）系统能够排除孕期和产后环境变量的干扰，子代的表型完全来自于在母体不良内环境的卵母细胞。研究者对高糖小鼠卵母细胞发育而来的子代小鼠进行健康监测，发现其糖代谢受损，葡萄糖耐受能力不足（impaired glucose tolerance），主要表现为胰岛素分泌不足。有趣的是，高糖环境只能影响子一代小鼠，而在子二代小鼠中并未发现健康问题。
为了寻找高糖的卵母细胞介导子代葡萄糖耐量受损的关键机制，研究人员对孕前高糖小鼠的MII卵母细胞进行了组测序，发现母源效应因子Tet3在高糖小鼠的卵母细胞中表达下降。徐国良研究组曾在2011年Nature中了卵细胞来源的TET3双加氧酶主要负责对受精卵中父本基因组DNA胞嘧啶甲基的氧化修饰，从而启动DNA的去甲基化和重编程【4】。进一步分析发现，高糖组受精卵的雄原核中TET3蛋白水平降低，相应的氧化产物5hmC减少。
随后，研究人员对高血糖小鼠的子代胰岛进行了全基因组甲基化测序。结果显示，启动子区域高甲基化的基因主要富集在胰岛素分泌通（insulin secretion pathway）中，其中包括编码胰岛素分泌限速酶葡萄糖激酶基因Gck（Glucokinase）。以Gck的启动子区域为例，研究人员发现胰岛素分泌基因的高甲基化最早出现于受精卵的雄原核，并一直延续到子代成年小鼠的胰岛中，并呈现父本性的高甲基化。这些结果均提示了在高糖小鼠的子代中，胰岛素分泌基因的高甲基化来源于受精卵的雄原核，且持续到子代。
为了进一步明确子代葡萄糖不耐受的表型和胰岛素分泌相关基因的DNA甲基化谱式的改变是由于卵母细胞中TET3表达的下降引起的，研究人员检测了卵母细胞性纯合或杂合敲除Tet3的小鼠子代，发现这些子代小鼠也呈现Gck基因的高甲基化与糖耐量受损的表型。此外，在高糖小鼠的MII卵母细胞中回补Tet3 mRNA可以很大程度恢复甲基化水平和子代表型。这些遗传学印证了TET3是卵母细胞中介导高糖环境导致子代血糖代谢受损的重要因子。有趣的是，虽然TET3下调发生于卵母细胞中，反而是受精后的父源基因组Gck启动子甲基化水平出现了更大程度的上升，原因是TET3是一个重要的母源因子，其主要负责受精后的主动去甲基化过程，而该过程有着一定的父源基因组偏好性。
值得注意的是，在生殖中心收取的糖尿病患者的未成熟GV期卵母细胞和体外培养的弃用囊胚也分别显示出TET3 mRNA表达降低的趋势和GCK启动子区域高甲基化的状态。这表明小鼠模型中的发现也有重要的临床意义。
综上所述，该研究以孕前高血糖环境为例，深入探讨了卵母细胞TET3介导的子代远期糖代谢受损的表观遗传机制，提示了卵母细胞发育时期是一个对环境的窗口期，母源TET3的正常功能作用于父源基因组，进而决定子代健康。该项工作还提示我们：为降低子代出现慢性疾病的风险，将妇女基础疾病的预防和筛查提前到孕前期，可能是预防人群中糖尿病等慢性病的重要策略。该研究也为育龄期健康管理和慢性疾病防控提供了新的理论基础。
值得一提的是，针对这项研究，Nature同期配发了弗里德希-米斯科舍生物医学研究所Antoine H. F. M. Peters的评述：“本研究发现了一种通过雌性生殖系传递子代表型的新机制，了高血糖使得卵子中TET3双加氧酶的表达异常降低，阻碍了受精后对精子来源DNA的氧化去甲基化过程，进而导致了成年后代的代谢受损。”
另据悉，美国科学院院士Marisa Bartolomei和美国国家生殖表观基因学研究中心主任Wei Yan教授在Biology of Reproduction上为该工作撰写亮点评论：“该研究不仅建立了高血糖症通过卵母细胞对子代表观基因组产生不利影响与后代易患代谢紊乱之间的联系，还了潜在的机制。之前，这一假设从未得到验证，更不用说调节的机制了。”
复旦大学生殖与发育研究院、教育部生殖遗传重点实验室黄荷凤院士和中科院细胞科学卓越创新中心及复旦大学生物医学研究院的徐国良院士为该论文的共同通讯作者。浙江大学医学院附属邵逸夫医院陈宾博士、中科院细胞卓越中心杜雅蕊副研究员、复旦大学生殖与发育研究院朱虹博士、中科院细胞卓越中心孙美玲博士和王超博士为该文的共同第一作者。该工作还得到了浙江大学医学院盛建中教授、英国阿尔斯特大学Peter R Flatt教授等的大力支持和帮助。
人类的基因是人类历史最的记录者，从生命诞生之时起，便用‘基因语言’记录下了所经历的沧桑往事。如果说基因是一种内在密码，那么基因和环境相互作用后会影响密码的编程而不同的表型，基因和环境互作效应现今被认为在人类健康与疾病中发挥重要作用，但其发病的机制至今未解。要搞清楚其中的关系，也并非易事。
1995年，英国南安普顿大学流行病学家Barker提出了健康与疾病的发育起源学说（Developmental Origins of Health and Disease, DOHaD）。认为胎儿在孕中晚期营养不良会引起成年期易患糖尿病、高血压和冠心病，解释了生命早期环境在成年慢性疾病发生中的现象。这一发现所引发医学科学热潮，促使科学家和临床医生们在人类生命早期健康和预防疾病研究思上发生了转变。然而，胎儿源性疾病的主要理论基础来源于基于人群的大规模临床流行病学调查，而在发生机制方面极少有深入的阐释和突破。
科学家们最先想到通过动物实验来验证。在利用动物模型验证的过程中，科学家们将一些传统的观念如基因与环境之间的相互作用导致疾病的易感性等，进一步扩展，并提出表观遗传也可作为一个重要的决定人类疾病起源的因素。这一发现又掀起了另一波探索热潮，这一阶段的研究多注重“果”， 从表型到机制多个模型验证了遗传效应和表观修饰改变的存在，为表观遗传在疾病起源性研究奠定了基础。但遗憾地是，生命早期环境因素与疾病起源的“因”却迟迟未能揭秘。
在国内提到发育源性疾病，第一个想到的是黄荷凤院士。黄院士团队开展了一系列环境因素对子代健康的研究，首次报道了孕期糖尿病引起跨代和隔代遗传效应。课题组相继探讨了孕期环境影响子代体细胞表观遗传修饰引发其代谢、心血管和神经认知等功能异常的作用机制。随后又发现环境对生殖细胞重编程影响，环境因素后改变生殖细胞重编程中DNA甲基化修饰关键酶的水平。从体细胞到生殖细胞拓展，使黄荷凤院士也从关注胎儿期影响前移到配子发育期，率先提出了“疾病的配子源性”假设。
合作团队徐国良课题组近年来则一直致力于Tet双加氧酶及其介导的DNA氧化去甲基化的机理及生物学功能研究。发现Tet酶能够迭代氧化5mC，依次产生5hmC、5fC和5caC，DNA糖苷酶TDG识别5caC启动碱基切除修复途径完成DNA去甲基化。基于这条DNA主动去甲基化通，徐院士课题组深入探讨了其在小鼠早期胚胎发育、成体神经发生与认知、体细胞重编程及原肠运动中的生物学功能，研究斐然。
一个假设被成功论证，是最终成为理论学说的前提。喜见黄荷凤院士和徐国良院士的合力之作，他们发表在本期Nature的以糖尿病的卵子起源为例验证了“疾病的配子源性”，更为欣喜地是他们寻找到了这一遗传模式的关键机制并予以。
这次发现了大家对发育源性疾病新认知，关键是成功地揭开了隐藏在背后的表观遗传机制。从1995年Barker提出开始，由于具体调控机制和方式的不确定，许多人对疾病的发育起源尚存疑惑。本研究中，研究人员在给糖尿病小鼠实施了大家熟悉的“试管婴儿”和“”术，在排除孕期和产后的因素后，发现卵母细胞可作为体内代谢的“感受器”，在糖尿病状态后，卵细胞中Tet3水平降低，与精子受精后，在生命伊始便通过干扰父本基因组的去甲基化影响了后代致病基因表观修饰，将糖尿病易感性传递给了后代。研究解析了生命早期环境与基因的互作效应在成年慢病发生中重要调控机制，是发育源性疾病的重大理论突破。
科研探索更高的目标是将科研能够真正最终回馈人类和社会。黄荷凤院士作为中国发育源性疾病和出生缺陷防控的者，牵头了国际多中心随机整群对照“生命健康轨迹”计划，建立了孕前-孕期-产后-儿童的系列临床研究队列，了发育源性疾病临床实践的新篇章，并结合基础研究，将慢病尤其是糖尿病的发生机制研究进一步前移。慢病的防治已经拓展至全生命周期，依赖于从、细胞器、细胞、组织器官和个体水平的基于机体“整体观”的深入研究。近年来有研究者尝试通过包括菌群、代谢物、多组学数据预测慢病的发病，但更重要的是为有效防治慢病提供有价值的科学依据，为消减慢病提供可操作性的临床干预和预警方案。创新的带来全新的防治，期待在我们年轻一代人的身上，源头阻断疾病、提高老百姓健康生活质量将不再只是梦想！
以往对表观遗传继承性（epigenetic inheritance）的研究主要集中在代内细胞有丝过程中的继承，近年来哺乳动物跨代表观遗传继承性成为了一个前沿热点。然而，跨代表观遗传继承其实不是一个非常精确的学术名词，大概包括了下面三类主要的情况：1. 哺乳动物孕期因胚胎于不良宫内环境使得出生后子代受到影响；2. 哺乳动物配子发生过程中出现的表观遗传变化对子一代的影响；3. 哺乳动物个体生活史中获得的表观遗传变化对子一代及其后代的影响。严格来说，第一种情况并非真正意义的跨代表观遗传继承，其反应的其实是由宫内环境诱发的胚胎表观遗传变化及其在有丝过程中的继承。而后两种情况则更符合“跨代继承”的定义。由黄荷凤与徐国良两个研究团队完成的该项研究属于对上述第二种情况的拓展和延伸，以往的工作聚焦在配子向子代在表观信息上的直接继承，而该工作筛选出亲代卵母细胞中母源效应因子/去甲基化修饰酶Tet3的剂量不足影响到受精卵，介导后代表观信息改变的跨代遗传的效应。这个发现提示了在配子发生过程中，表观修饰蛋白也可以作为一种继承的载体，介导跨代遗传的效应。
该研究始于一个重要的临床观察，妊娠期糖尿病患者孕期的高糖使得后代相对糖尿病高发。该团队提出一个重要科学问题：孕前卵母细胞的不良环境，是否也会影响到子代呢？该临床现象的本质是否涉及跨代表观遗传继承？
为了回答上述科学问题，首先需要建立一个动物模型。此前，已知链脲霉素药物的处理能够损害胰腺β细胞进而诱发高血糖，因此该团队测试了链脲霉素处理诱发的高血糖是否能影响卵母细胞进而导致子代糖尿病的高发。为了排除母亲宫内和哺育时高糖环境的影响，该团队设计了一个精巧的实验，将受到高糖影响的雌鼠的卵子取出后体外受精，并植入正常雌鼠的子宫。对子代小鼠进行葡萄糖耐量测试，结果显示卵母细胞有高糖史的子一代小鼠出现糖尿病高发。重要的是，这一事件仅在子一代发生，不会传递给子二代小鼠。这一系列的实验不仅建立了动物模型，也明确了该现象属于哺乳动物卵子发生过程出现的表观遗传变化对子一代的影响。
为了鉴定高糖的雌鼠卵母细胞中究竟哪些表观遗传事件出现了异常，该团队对高血糖雌鼠的MII期卵母细胞的组进行了分析，并观察到了DNA双加氧酶Tet3的下调。不仅如此，在糖尿病患者的GV期卵母细胞中也观察到了TET3的下调。
Tet3负责在受精卵中进行主动去甲基化，而这正是由徐国良团队早年发现的。因此，他们测定了经链脲霉素处理的雌鼠的卵子受精后胎鼠的DNA甲基化组，并发现糖尿病相关基因Gck 的启动子出现了DNA甲基化异常上调，并且Gck 启动子的异常高甲基化状态可以从胚胎期一直持续到成体的胰岛细胞，从而导致Gck 基因的下调和糖尿病的发生。这里需要强调的是，此前就已知Gck基因具有单倍剂量不足就能导致糖尿病发生的特点。因此，DNA甲基化上调导致的Gck 基因表达下调足以导致糖尿病的发生。
有趣的是，虽然Tet3下调发生于卵母细胞中，受精后反而是父源基因组Gck启动子甲基化由于缺乏足够的氧化去甲基化而维持了较高程度的甲基化。原因是Tet3是一个重要的母源因子，其主要负责受精后的主动去甲基化过程，而该过程有着一定的父源基因组偏好性。
最后，作者团队提供了两项重要的遗传学：1. Tet3母源敲除小鼠的子代糖尿病高发；2. 在经链脲霉素处理的雌鼠的卵母细胞中高表达Tet3能够其子一代小鼠的糖尿病表型。
科学研究中常常提到的十二个字是“仔细观察、大胆假设、小心求证”。我在读这一论文的过程中感触最深的是“小心求证”这四个字。无论是这一研究中利用小鼠撇除宫内环境影响的精巧设计，对子代表型的精准分析，还是文末两个实验提供的遗传学，都深深体现了“小心求证”这四个字。
最后，我想很多读者会问为什么这一事件只在子一代发生，而不能传递到子二代以后。DNA甲基化是最稳定的表观遗传修饰，但也是在配子发生过程中被抹除得最干净的表观遗传修饰，因此在下一代配子发生的过程中又会回归到野生型的状态，这样才能配子的质量，帮助我们每一代都能做到“重新”。